CRISP-Cas9

Metoda CRISPR/Cas9 pozwala na wprowadzenie w ściśle określonych miejscach DNA dwuniciowych pęknięć. Choć komórka jest w stanie połączyć ze sobą takie pęknięte fragmenty DNA, to jednak proces ten jest niedoskonały i prowadzi do licznych zmian w DNA i w konsekwencji do wyłączenia obecnego w tym miejscu genu. Tzw. "genetyczne nożyczki" będące podstawą nowych rozwiązań terapeutycznych w leczeniu chorób genetycznych mogę powodować nieoczekiwane mutacje, przekazywane kolejnym pokoleniom - podało pismo "Nature Communications".
CRISPR-Cas9 może wywoływać dziedziczne zmiany w genomie
Jak wykazały nowe badania naukowców z uniwersytetu w Uppsali (Szwecja), metoda CRISPR-Cas9 może powodować nieprzewidziane zmiany w DNA, które mogą być dziedziczone przez następne pokolenie. Dlatego autorzy zalecają ostrożność i skrupulatną walidację przed użyciem CRISPR-Cas9 do celów medycznych.
- W tym projekcie badaliśmy wpływ CRISPR-Cas9 na danio pręgowanego, małą rybkę akwariową. Ponieważ cząsteczki DNA i ich mechanizmy są podobne u wszystkich zwierząt, uważamy, że wyniki powinny być podobne u ludzi - zaznaczył Adam Ameur, profesor nadzwyczajny na Uniwersytecie w Uppsali i Laboratorium Nauki dla Życia (SciLifeLab).
Badając genomy ponad 1000 danio pręgowanych z dwóch pokoleń, naukowcy odkryli nieoczekiwane mutacje różnych typów. W niektórych przypadkach fragmenty DNA, które uległy zmianom, były większe niż oczekiwano, w innych - mutacje wystąpiły w niewłaściwym miejscu genomu. Nieprzewidziane mutacje wykryto w pierwszym pokoleniu danio pręgowanego, ale także u jego potomstwa.
Uniwersytet Jagieloński mimo skuteczności szczepionek przeciw SARS-Cov-2 pojawiające się nowe warianty wirusa wymagają poszukiwania kolejnych sposobów przeciwdziałania zakażeniom. Pomocne będzie już samo stosowanie szczepionek genetycznych, opartych na kwasach nukleinowych – czy to mRNA, jak w przypadku produktów Pfizer/BioNtch oraz Moderna czy zbudowanych z DNA wektorów adenowirusowych w szczepionkach AstraZeneca oraz Johnson & Johnson.
Szczepionka mRNA przeciw COVID-19 a neurodegeneracyjne choroby prionowe.

Wprowadzenie
Wiadomo, że szczepionki powodują szereg przewlekłych, późno rozwijających się skutków ubocznych. Niektóre z nich, takie jak cukrzyca typu 1, mogą wystąpić dopiero po 3-4 latach od podania szczepionki. Na przykładzie cukrzycy typu 1 częstość występowania skutków ubocznych może przewyższać częstość przypadków ciężkiej choroby zakaźnej, której szczepionka ma zapobiegać. Biorąc pod uwagę, że cukrzyca typu 1 jest tylko jedną z wielu chorób o podłożu immunologicznym, które mogą być wywoływane przez szczepionki, przewlekłe późno występujące skutki uboczne stanowią poważny problem dla zdrowia publicznego.
Pojawienie się nowej technologii szczepionek stwarza nowe potencjalne mechanizmy skutków ubocznych szczepionek. Na przykład pierwsza nieudana szczepionka przeciwko polio w rzeczywistości spowodowała polio u biorców, ponieważ proces produkcyjny na większą skalę przed wstrzyknięciem go pacjentom nie unieszkodliwił skutecznie wirusa polio.
Szczepionki na bazie RNA oferują szczególne ryzyko spowodowania określonych skutków ubocznych. Jednymi z nich są choroby prionowe spowodowane aktywacją białek wewnętrznych do tworzenia prionów.
Opublikowano bogatą wiedzę na temat klasy białek wiążących RNA, które, jak wykazano, uczestniczą w wywoływaniu wielu chorób neurologicznych, w tym choroby Alzheimera i ALS (Amyotrophic lateral sclerosis). TDP-43 i FUS należą do najlepiej zbadanych z tych białek.
Szczepionka mRNA przeciw COVID-19 firmy Pfizer została zatwierdzona przez amerykańską FDA w ramach zezwolenia na stosowanie w stanie szczególnego zagrożenia bez konieczności przeprowadzenia długoterminowych badań dotyczących ich bezpieczeństwa.
Ze względu na obawy dotyczące bezpieczeństwa tej szczepionki przeprowadzono badanie w celu ustalenia, czy szczepionka może potencjalnie wywołać chorobę wywołaną prionami.
Choroby prionowe
Choroby prionowe, czyli neurodegeneracyjnych zakaźne encefalopatie gąbczaste, to choroby układu nerwowego zwierząt i ludzi spowodowane nagromadzeniem białek prionowych. Priony są glikoproteinami kodowanymi przez genom gospodarza, które mają nieprawidłową strukturę przestrzenną.
Białka prionowe występują powszechnie w komórkach organizmu, zwłaszcza w tkance nerwowej. Są to ważne fizjologiczne glikoproteiny błonowe pełniące różnorodne funkcje w organizmie. Gdy do komórki zawierającej prawidłowe białko prionowe dostanie się nieprawidłowa cząsteczka prionowa, dochodzi do zmiany struktury przestrzennej prawidłowych białek komórkowych na nieprawidłową. W ten sposób dochodzi do kumulacji nieprawidłowego białka w ośrodkowym układzie nerwowym i szerzenia się patologii oraz degeneracji kolejnych komórek nerwowych. W piśmiennictwie medycznym podkreśla się podobieństwo patogenetyczne chorób wywołanych przez priony do choroby Alzheimera.
Wśród chorób prionowych, których występowanie potwierdzono u ludzi wymienia się: chorobę Creutzfeldta i Jakoba (Creutzfeldt-Jakob disease – CJD), która może występować w kilku postaciach (rodzinnej – fCJD, sporadycznej – sCJD, wariantowej – vCJD, jatrogennej – jCJD), postać wzgórzową CJD określaną też jako śmiertelna , sporadyczna bezsenność, chorobę Gerstmanna, Strausslera i Scheinkera (GSS), chorobę kuru, oraz śmiertelną rodzinną bezsenność (fatal familial insomnia – FFI)
Choroby wywołane przez priony są nieuleczane. Charakteryzują się wieloletnim okresem inkubacji i dość szybką progresją choroby od chwili pojawienia się pierwszych objawów, prowadzącą do śmierci chorego.
Metody
Szczepionka mRNA przeciw COVID-19 firmy Pfizer została oceniona pod kątem potencjału przekształcenia TDP-43 i / lub FUS w stany wywołujące choroby oparte na prionach. RNA szczepionki analizowano pod kątem obecności sekwencji mogących aktywować TDP-43 i FUS. Przeanalizowano interakcję transkrybowanego białka szczytowego z jego celem, aby określić, czy to działanie może również aktywować TDP-43 i FUS.
Wyniki
Analiza szczepionki mRNA przeciw COVID-19 firmy Pfizer pozwoliła zidentyfikować dwa potencjalne czynniki ryzyka wywołania choroby prionowej u ludzi. Sekwencja RNA w szczepionce zawiera sekwencje, o których uważa się, że indukują agregację TDP-43 i FUS w ich konformacji opartej na prionach, co prowadzi do rozwoju powszechnych chorób neurodegeracyjnych. W szczególności wykazano, że sekwencje RNA GGUA, sekwencje bogate w UG, powtórzenia tandemowe UG i sekwencje G Quadruplex mają zwiększone powinowactwo do wiązania TDP-43 i / lub FUS i mogą powodować, że TDP-43 lub FUS przyjmują konfiguracje patologiczne w cytoplazma. W bieżącej analizie zidentyfikowano łącznie szesnaście powtórzeń tandemowych UG (ΨGΨG) i zidentyfikowano dodatkowe sekwencje bogate w UG (ΨG). Znaleziono dwie sekwencje GGΨA. Sekwencje G Quadruplex są prawdopodobnie obecne, ale do ich weryfikacji potrzebne są zaawansowane programy komputerowe.
Białko szczytowe kodowane przez szczepionkę wiąże enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2), enzym zawierający cząsteczki cynku. Wiązanie białka szczytowego z ACE2 może doprowadzić do uwolnienia cząsteczki cynku, jonu, który powoduje, że TDP-43 przyjmuje patologiczną transformację prionu.
Dyskusja
Istnieje stare powiedzenie, że "lekarstwo może być gorsze niż choroba". Można je zastosować w kontekście szczepionek. W obecnym artykule pojawia się pytanie, czy szczepionki mRNA przeciw COVID-19 mogą potencjalnie powodować więcej ubocznych zachorowań niż sama epidemia COVID-19. W artykule skupiono się na nowym potencjalnym mechanizmie ciągu zdarzeń skutków ubocznych powodujących chorobę prionową, która może być nawet częstsza i bardziej wyniszczająca niż sama infekcja wirusowa, której ma zapobiegać ta szczepionka. Choć niniejszy artykuł koncentruje się na jednej z opcji, istnieje wiele innych potencjalnie śmiertelnych skutków ubocznych które omówiono poniżej.
W ciągu ostatnich dwóch dekad niektórzy naukowcy obawiali się, że priony mogą być używane jako broń biologiczna. Niedawno pojawiła się obawa, że wszechobecne cząsteczki wewnątrzkomórkowe mogą zostać aktywowane, powodując choroby prionowe, w tym chorobę Alzheimera, ALS i inne choroby neurodegeneracyjne. Obawa ta wynika z możliwości niewłaściwego wykorzystania danych badawczych dotyczących mechanizmów, za pomocą których niektóre białka wiążące RNA, takie jak TDP-43, FUS i inne, mogą być aktywowane w celu utworzenia prionów powodujących choroby. Fakt, że te badania, które mogłyby zostać wykorzystane do rozwoju broni biologicznej, są finansowane przez organizacje prywatne, w tym Fundację Billa i Melindy Gatesów oraz Fundację Medyczną Ellisona bez krajowego lub międzynarodowego nadzoru, również budzi niepokój. W przeszłości również obowiązywały zakazy publikowania informacji o budowie bomb atomowych.
Opublikowane dane wykazały, że istnieje kilka różnych czynników, które mogą przyczyniać się do konwersji niektórych białek wiążących RNA, w tym TDP-43, FUS i cząsteczek pokrewnych, do ich stanów patologicznych. Te białka wiążące RNA mają wiele funkcji i znajdują się zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Te białka wiążące mają aminokwasowe elementy, które wiążą specyficzne sekwencje RNA. Uważa się, że wiązanie z określonymi sekwencjami RNA, gdy białka znajdują się w cytoplazmie, powoduje fałdowanie cząsteczek w określony sposób, prowadząc do patologicznej agregacji i tworzenia prionów w cytoplazmie. Obecna analiza wskazuje, że szczepionka mRNA przeciw COVID-19 firmy Pfizer zawiera wiele z tych sekwencji RNA, które, jak wykazano, mają wysokie powinowactwo do TDP-43 lub FUS i mogą wywoływać przewlekłe zwyrodnieniowe choroby neurologiczne.
Wiązanie cynku z motywem rozpoznawania RNA w TDP-43 jest kolejnym mechanizmem prowadzącym do tworzenia agregatów podobnych do amyloidu. Motyw rozpoznawania RNA, RNP-1, jest domniemaną domeną wiążącą RNA złożoną z około 90 aminokwasów, o których wiadomo, że wiążą jednoniciowe RNA.
Wirusowe białko szczytowe, kodowane przez sekwencję RNA szczepionki, wiąże ACE2, enzym zawierający cząsteczki cynku. Ta interakcja może zwiększyć wewnątrzkomórkowe poziomy cynku, prowadząc do choroby prionowej. Początkowe wiązanie mogłoby zachodzić między białkami szczytowymi na powierzchni komórki transfekowanej szczepionką a ACE2 na powierzchni sąsiedniej komórki. Powstały kompleks może zostać zinternalizowany. Alternatywnie, interakcja mogłaby początkowo mieć miejsce w cytoplazmie komórki, która wytwarza ACE2 i została transfekowana RNA szczepionki kodującym białko szczytowe. Interakcja jest dość niepokojąca, biorąc pod uwagę przekonanie, że wirus wywołujący COVID-19, SARS-CoV-2, jest bronią biologiczną i możliwe, że wirusowe białko szczytowe mogło zostać zaprojektowane do wywoływania choroby prionowej.
Innym problemem jest to, że szczepionka mRNA firmy Pfizer wykorzystuje unikalny nukleozyd RNA 1-metylo-3′-pseudouridylyl (Ψ). Według dokumentów informacyjnych FDA ten nukleozyd został wybrany w celu zmniejszenia aktywacji wrodzonego układu odpornościowego. Cząsteczki RNA zawierające ten nukleozyd niewątpliwie będą miały zmienione wiązanie. Niestety, nie opublikowano wpływu na TDP-43, FUS i inne białka wiążące RNA. Zastosowanie tego nukleozydu w szczepionce może potencjalnie zwiększyć powinowactwo wiązania sekwencji RNA, które mogą powodować, że TDP-43 i FUS przyjmują konfiguracje toksyczne.
Istnieje wiele innych potencjalnych skutków ubocznych, które mogą być wywołane przez nowe szczepionki mRNA przeciw COVID-19. Szczepionka umieszcza nową cząsteczkę, białko szczytowe, w / na powierzchni komórek gospodarza. To białko szczytowe jest potencjalnym receptorem dla innego prawdopodobnie nowego czynnika zakaźnego. Jeśli ci, którzy twierdzą, że COVID-19 jest w rzeczywistości bronią biologiczną, mają rację, to może zostać uwolniony drugi, potencjalnie bardziej niebezpieczny wirus, który wiąże białko szczytowe znalezione w komórkach gospodarza biorców szczepionki. Dane nie są publicznie dostępne, aby dostarczyć informacji o tym, jak długo RNA szczepionki ulega translacji u biorcy szczepionki i jak długo po translacji białko wypustki będzie obecne w komórkach biorcy. Takie badania dotyczące ekspresji in vivo będą złożone i trudne. Różnorodność genetyczna chroni gatunki przed masowymi ofiarami powodowanymi przez czynniki zakaźne. Jedna osoba może zostać zabita przez wirusa, podczas gdy inna może nie mieć żadnych negatywnych skutków działania tego samego wirusa. Poprzez umieszczenie identycznego receptora, białka szczytowego, na komórkach każdej populacji, znika różnorodność genetyczna co najmniej jednego potencjalnego receptora. Każdy w populacji staje się teraz potencjalnie podatny na wiązanie się z tym samym czynnikiem zakaźnym.
Autoimmunizacja i stan przeciwny, zespół metaboliczny, to dobrze znane skutki uboczne wywoływane przez szczepionki. Infekcje COVID-19 są związane z indukcją autoprzeciwciał i chorobami autoimmunologicznymi, co sprawia, że szczepionka może zrobić to samo. Jeden z autorów stwierdził, że sekwencje aminokwasów kodowane przez białko szczytowe są identyczne z sekwencjami w ludzkich białkach, w tym w białkach znajdujących się w ośrodkowym układzie nerwowym. Autoimmunizację można również wywołać przez rozprzestrzenianie się epitopów, gdy obcy antygen, taki jak białko szczytowe, jest prezentowany przez komórkę prezentującą antygen, która również ma własne cząsteczki przyłączone do swoich cząsteczek MHC.
Inni naukowcy prowadzący badania w tej dziedzinie opublikowali materiały wspierające tezę, że szczepionki COVID-19 mogą potencjalnie wywołać chorobę prionową. Autorzy znaleźli sekwencje związane z prionami w białku szczytowym COVID-19, których nie znaleziono w pokrewnych koronawirusach. Inni opisali przypadki choroby prionowej, choroby Creutzfeldta-Jakoba, w fazie początkowej u pacjentów z COVID-19.
Zatwierdzenie szczepionki przy użyciu nowatorskiej technologii RNA bez szeroko zakrojonych testów jest niezwykle niebezpieczne. Szczepionka może stać bronią biologiczną, o wiele bardziej niebezpieczną niż pierwotna infekcja.